1收集精子

禁欲期(通常為3～5d)后，用手淫方法將精子收集于10～20mL無(wú)菌的聚丙烯樣品收集容器中。要求禁欲期是為了更好地冷凍保存樣品。通常而言，這樣的精子與收集前禁欲期較短及不規(guī)則的精子相比，冷凍保存后的特性更恒定且更完善。

射出的精液是液態(tài)的，但正常情況下立即凝結(jié)成膠狀。凝結(jié)后的精液通常在30min內(nèi)液化，此時(shí)就可測(cè)定其體積。為了使精子獲得較大的冷凍存活力，應(yīng)在收集精液后1min內(nèi)開(kāi)始對(duì)液化精子進(jìn)行冷凍保存處理。

2體積的測(cè)量

體積可用較準(zhǔn)的加樣器或帶針頭的5mL注射器來(lái)測(cè)量，有時(shí)也可根據(jù)收集精液前后采樣瓶的重量之差來(lái)計(jì)算。取0.1～0.2mL精液作精液分析(活動(dòng)精子的百分?jǐn)?shù)及其質(zhì)量、精子密度等，參見(jiàn)本書有關(guān)章節(jié))，此外尚需取出一些精液，同時(shí)以用來(lái)做篩選某種性傳染疾病的檢測(cè)、進(jìn)行某些檢測(cè)以篩選導(dǎo)致性病的微生物如奈瑟淋球菌等(詳見(jiàn)有關(guān)章節(jié))。

3甘油化

甘油作為冷凍保護(hù)劑，可以分步方式直接加入到未經(jīng)處理的精液之中。每次加入后混勻，時(shí)間間隔為1min;或間接地作為擴(kuò)張液或基液的組分，經(jīng)稀釋后逐步加入精液。而在美國(guó)與加拿大，40%以上的著名精子庫(kù)，仍多帶帶使用甘油作為冷凍保護(hù)劑，而越來(lái)越多的新的精子庫(kù)則使用擴(kuò)張劑，尤其是含甘油的兩性離子緩沖系統(tǒng)。

甘油化的條件不一定涉及溫度的特殊條件(除了室溫之外)和接觸時(shí)間(除了加入甘油及混勻所需時(shí)間之外)。

4包裝和存活力觀察

甘油化的精液可吸入塑料吸管(可用封口劑，加熱，或用尼龍塞來(lái)密封)或放入玻璃安瓿(用火焰封口)，也可放入塑料冷凍管(冷凍小瓶)后用螺口蓋擰緊。每份冷凍精液的體積通常是0.4～0.8mL，這可作為人工授精的一個(gè)單位。當(dāng)然如果合適，人工授精也可能使用一個(gè)單位以上的精液，選擇用于冷凍保存精子的容器是很重要的。這種容器應(yīng)是易于標(biāo)記、操作、儲(chǔ)存，同樣也應(yīng)具有很好的生物兼容性以及抗壓性能。高質(zhì)量的聚丙烯吸管或小瓶看來(lái)符合這些標(biāo)準(zhǔn)，而沒(méi)有易碎及被洗滌劑污染等玻璃容器所具有的缺點(diǎn)。

放入液氮冷凍之前，除了要對(duì)被冷凍和儲(chǔ)備的精子進(jìn)行分裝以外，還需準(zhǔn)備一份質(zhì)量控制檢測(cè)樣品。對(duì)收集后未經(jīng)處理的精液、用冷凍保護(hù)劑處理過(guò)的精液以及儲(chǔ)存前、凍融后的精液均應(yīng)觀察其中的活動(dòng)精子及其活動(dòng)力。通過(guò)觀察能追蹤冷凍保存各階段的精子生存情況，并能確保了解冷凍精子的存活能力。

5冷凍

吸管、安瓿中的精液冷凍保存時(shí)可分散或成組貯存，其位置保持垂直、水平或傾斜。通常是放在液氮?dú)忪F中，有時(shí)也可放在機(jī)械(電子)冷凍柜的冷凍氣中。冷卻和冷凍過(guò)程則可用人工以靜態(tài)或逐步方式，也可用電腦控制的液氮供給系統(tǒng)來(lái)完成。常用的是操作者利用液氮儲(chǔ)存容器中的氣相以直接一次性或逐漸方式進(jìn)行冷凍。帶有吸附液氮的石棉襯墊的生物干燥運(yùn)送器，也能在氣相中用于冷凍，然后在液相中轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存容器。

6儲(chǔ)存

經(jīng)分裝的樣品，均應(yīng)貯存在金屬容器內(nèi)的液氮之中，而這些容器則應(yīng)放置在適當(dāng)?shù)囊旱鋬鱿渲畠?nèi)。用以監(jiān)視液氮水平面的裝置[機(jī)械的和(或)電子的]是為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存在高于液氮溫度( -196℃)的情況下防止喪失精子功能，監(jiān)視水平面的常見(jiàn)機(jī)械(手工)方法是將一根帶刻度的插桿垂直放入液氮底部后拔出，則在其上面就會(huì)形成一條霜線，以指示液氮水平面，至于各種復(fù)雜的局部和遙控電<愛(ài)尬聊_百科大全>子警報(bào)系統(tǒng)現(xiàn)許多國(guó)家均已有市售。另一方面，少數(shù)精子庫(kù)只使用閃爍燈定期用肉眼檢查，AATB的組織庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)只要求一個(gè)有效的監(jiān)測(cè)程序，以確保樣品始終儲(chǔ)存在液氮表面之下。冷凍生物學(xué)家和有關(guān)研究人員，通過(guò)融解儲(chǔ)存前樣品，并進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在冷凍剛開(kāi)始期間精子活動(dòng)力有某些丟失。然而以后儲(chǔ)存在液氮表面之下-196℃的冷凍精子，活動(dòng)力沒(méi)有進(jìn)一步丟失，人們已經(jīng)證實(shí)癌癥患者治療前精液中的精子冷凍生存活動(dòng)力往往是差的(解凍后精子活動(dòng)力百分?jǐn)?shù)降低)，盡管如此，這降低了的運(yùn)動(dòng)能力在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間并不進(jìn)一步降低。

在所調(diào)查的42家AATB成員的組織庫(kù)中，只有2家報(bào)道了精液[由正常供精者及(或)治療前患者提供]長(zhǎng)期保存期間精子活動(dòng)力喪失的例子。另有報(bào)道只有1例冷凍保存3年后精子活動(dòng)力喪失。可以為人們所接受的觀點(diǎn)是，貯存過(guò)程中精子活動(dòng)力喪失系冷凍前沒(méi)有準(zhǔn)確測(cè)定所致或更可能是由于沒(méi)有確保較佳儲(chǔ)存條件所造成的。

7解凍

將裝有冷凍精子的包裝盒暴露于空氣或水中即可使冷凍精液恢復(fù)液態(tài)。通常暴露在室溫，但也可暴露在其他溫度下，這要根據(jù)各精子庫(kù)設(shè)計(jì)的方法學(xué)而定。

8分發(fā)

若臨床醫(yī)師需要冷凍精子以開(kāi)展IVF-ET，精子庫(kù)應(yīng)按要求送到該醫(yī)師所在醫(yī)院(或)診所。冷凍精子從精子庫(kù)的貯存柜取出后應(yīng)放在預(yù)先盛有液氮或固體二氧化碳(干冰)的特殊運(yùn)送盒內(nèi)。然而，精子庫(kù)若就在醫(yī)院內(nèi)，且離操作室甚近，則可不必放在上述特殊運(yùn)送盒內(nèi)，而可直接送到操作室供醫(yī)師使用。冷凍精子在送臨床使用前的融化有助于通過(guò)質(zhì)量控制，再次評(píng)估精子冷凍存活狀態(tài)。